Optimization of the genomic DNA extraction in some mosses

Document Type: Research Paper

Authors

1 MSc Graduate in Genetic, Young Researchers and Elite Club, North Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

2 PhD Graduate in Plant Systematic, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University, G.C. Tehran, Iran

3 Associate Prof., National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran

Abstract

The presence of organic compounds and high amount of secondary metabolites (polysaccharides, phenolic component, etc.) in mosses cause difficulties in DNA extraction that are followed by problems in PCR reactions. In lower plants, various methods have been used for DNA extraction including silica gel and different commercial kits. These methods mostly use hazardous (like phenol or liquid nitrogen) or costly (proteinase K) materials. Commercial kits are high cost. In order to develop an appropriate and cost effective procedure for DNA extraction in lower plants, the CTAB protocol was modified. Triton X-100, SDS, activated charcoal and ammonium acetate were used for the elution of the contaminations instead of the hazardous and risky materials. The method was compared with three extraction kits (Vivantus, Biobasic, and Rana), and tested on nine species of mosses including Neckera complanata, Anomodon viticulosus,Trichostomum brachydontium,Dicranum scoparium, Tortula sp., Plagiomnium cuspidatum,Homalothecium sericeum,Eurhynchium sp., and Neckera crispa from Iran. The quality and quantity of the extracted DNA was examined with spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. The lack of expensive proteinase K in this procedure had no unfavorable effect on the final results and helped to decrease the costs.

Keywords

Main Subjects


Article Title [Persian]

بهینه‌سازی روش استخراج DNA ژنومی در برخی خزه‌ها

Authors [Persian]

  • سمیه قاسم زاده برکی 1
  • صدیقه نیک ذات سیاهکلایی 2
  • امیر موسوی 3
1 دانش‌آموخته کارشناسی ارشد ژنتیک، باشگاه پژوهشگران جوان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، ایران
2 دانش‌آموخته دکتری سیستماتیک گیاهی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران
3 دانشیار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
Abstract [Persian]

در خزه‌گیان (بریوفیت‌ها)، به علت حضور ترکیبات آلی و متابولیت‌های ثانویه بسیار زیاد از قبیل پلی‌ساکاریدها و ترکیبات فنولی، استخراج DNA  و در پی آن واکنشPCR  با مشکلات متعددی مواجه است. با این حال، روش‌های متعددی جهت استخراج ژنوم در گیاهان غیرآوندی (بی‌گل) از جمله روش سیلیکاژل و همچنین کیت‌های مختلف تجاری توسط محققان مورد استفاده قرار گرفته است که از یک سو، پرهزینه و از سوی دیگر، ممکن است از لحاظ زیست محیطی دارای مواد خطرناکی باشند. با توجه به استفاده از مواد خطرناک همچون فنول، نیتروژن مایع و همچنین مقرون به صرفه‌ نبودن موادی همچون پروتیینازK  و کیت‌های استخراج، یافتن روشی مناسب برای کاهش این گونه ترکیبات
و کاهش هزینه‌ها بسیار ضروری به نظر می‌رسد. این مطالعه، با هدف معرفی روش استخراج بهینه شده CTAB در نه گونه خزه
در ایران شامل: Homalothecium sericeum، Neckera complanata،Anomodon viticulosus،Trichostomum brachydontium،
Dicranum scoparium، Tortula sp.،Plagiomnium cuspidatum،Eurhynchium sp. و Neckera crispaو مقایسه این روش با سه کیت استخراجDNA  Vivantus، Biobasic و Rana انجام شد. کمیت DNA های استخراج شده توسط روش نانومتری مشخص و جهت بررسی کیفیتDNA ی استخراج شده علاوه بر الکتروفورز ژل آگارز 1%، از دو نشانگر مولکولی SCoT وISSR  نیز استفاده گردید. نتایج نشان داد کهDNA ی ژنومی استخراج شده با وجود آلودگی نمونه‌ها به متابولیت‌های ثانویه، نسبتا دارای خلوص و کیفیت مطلوب‌تری می‌باشد و حذف مواد پرهزینه مانند نیتروژن مایع و پروتیینازK  و نیز استفاده از ترکیباتی همچون SDS، Triton X-100 و آمونیوم استات در جهت بهینه کردن کیفیتDNA  ژنومی از کارآیی مناسب‌تری برخوردار می‌باشد.

Keywords [Persian]

  • پروتییناز K
  • گیاهان بی‌گل
  • مواد خطرناک
  • هزینه‌بر
  • Triton X-100
Akhani, H. & Kürschner, H. 2004. An annotated and updated checklist of the Iranian bryoflora. Cryptogamie, Bryologie 25: 315–347.

Angeles, J.C., Laurena, A.C. & Mendoza, E.M. 2005. Extraction of genomic DNA from the lipid-polysaccharide & polyphenol-rich coconut (Cocos nucifera L.). Plant Molecular Biology Reporter 23: 297a–297i.

Crespo Padro, C.D., Terracciano, S., Giordano, S. & Spagnulo, V. 2014. Molecular markers based on PCR methods: a guideline for mosses. Cryptogamie, Bryologie 35: 229–246.

Doyle, J.J. & Doyle, J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13–15.

Fernandez, C., Shevock, J.R. & Glazer, A.N. 2006. Cryptic species within a cosmopolitan desiccation-tolerant moss: Grimmia laegivata. Proceedings of Natural Academy of Sciences 103: 637–642.

Ghahreman, A., Mehdigholi, K., Attar, F. & Nejadsattari, T. 2003. A preliminary study of moss flora of Golestan province and comparison with Iranian mosses. Iranian Journal of Botany 10: 63–81.

Goffinet, B., Hollowel, V.C. & Magill, R.E. 2004. Molecular Systematics of Bryophytes. Missouri Botanical Garden Press, USA. 448 pp.

Goffinet, B. & Buck, W.R. 2004. Systematics of Bryophyta: from molecules to a revised classification. Pp. 205–239.

Goffinet, B., Budke, J.M. & Newman, L. 2011. Micromitriaceae, a new family of highly reduced mosses. Taxon60: 1245–1254.

Heidari Japelaghi, R., Haddad, R. & Garoosi, G.A. 2011. Rapid and efficient isolation of high quality nucleic acids from plant tissues rich in polyphenols and polysaccharides. Molecular Biotechnology 49: 129–137.

Križman, M., Jakše, J., Baričevič Javornik, B. & Prošek, M. 2006. Robust CTAB-activated charcoal protocol for plant DNA extraction. Acta Agriculturae Slovenica 87(2): 427–433.

Kürschner, H. & Frey, W. 2011. Liverworts, mosses and hornworts of Southwest Asia (Marchantiophyta, Bryophyta, Anthocerotophyta). Nova Hedwigia (Suppl. 139): 240 pp.

Mikulaskova, E. & Fer, T. & Kucabova, V. 2012. The effect of different DNA isolation protocols and AFLP fingerprinting optimizations on error rate estimates in the bryophyte Campylopus introflexus. Lindbergia 35: 7–17.

Mittmann, F., Dienstbach, S. & Wagner, G. 2007. Large scale extraction of high quality moss DNA. Russian Journal of Plant Phys­iology 54: 564–568.

Moore, P.D. 1998. Plant extinction: frondless ferns lie low to survive. Nature392: 661–662.

Newton, A.E., Cox, C., Duckett, J.G., Wheeler, G., Goffinet, B., Hedderson, T.A.G. & Mishler, B.D. 2000. Evolution of the major moss lineages. The Bryologist103: 187–211.

Pedersen, N., Russel, S.J. & Newton, A.E. 2006. A novel molecular protocol for the rapid extraction of DNA from bryophytes and the utility of direct amplification of DNA from a single dwarf male. The Bryologist 109: 257–264.

Sahu, S.K., Thangaraj, M. & Kathiresan, K. 2012. DNA Extraction Protocol for Plants with High Levels of Secondary Metabolites and Polysaccharides without Using Liquid Nitrogen and Phenol. ISRN Molecular Biology.

Schlink, K. & Reski, R. 2002. Preparing high-quality DNA from moss Physcomitrella patens. Plant Molecular Biology 20: 423–423.

Smith, A.J.E. 2004. The Moss Flora of Britain and Ireland. Cambridge, Cambridge University Press. 1012 pp.

Vanderpoorten, A. & Shaw, A.J. 2010. The application of molecular data to the phylogenetic delimitation of species in bryophytes: A note of caution. Phytotaxa 9: 229–237.

Xin, Z.G., Velten, J.P. & Oliver, M.J. 2003. High-throughput DNA extraction method suitable for PCR. Biotech­niques 34: 820–826.